단백질 분리 및 정제를위한 단백질 분리 및 정제 기술

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침전 법을 용해법이라고도 합니다. 생명대분자물질을 순수화하는 기본 원리는 각종 물질의 구조적 차이에 따라 용액의 일부 성질을 변화시켜 유효 성분의 용해도가 변하는 것이다. < /p>

1, 염분석법 < /p>

염분석법은 단백질이 묽은 소금 용액에서 용해도가 소금 농도가 높아지면 높아지지만 소금 농도가 일정 수치로 높아지면 물 활성도가 낮아져 단백질 분자 표면 전하가 점차 중화되고 수화막이 점차 중화된다 < /p>

2, 유기용제침법 < /p>

유기용제가 단백질 용해도를 낮출 수 있는 두 가지 이유가 있다. 하나는 소금 용액처럼 탈수 작용을 하는 것이다. 둘째, 유기용제의 전기 상수는 물보다 작기 때문에 용제의 극성이 줄어든다. < /p>

3, 단백질 침전제 < /p>

단백질 침전제는 한 종류나 하나의 단백질 침전에만 작용하며, 흔히 알칼리성 단백질, 렉틴, 중금속 등이 있다. < /p>

4, 폴리에탄올 침전작용 < /p>

폴리에탄올과 우측선당황산나트륨 등 수용성 비이온형 중합체는 단백질을 침전시킬 수 있다. < /p>

5, 선택적침착법 < /p>

흡착기둥층은 고체 흡착제를 고정상으로, 유기용제나 완충액을 흐름상으로 기둥을 구성하는 층층층분석법이다. < /p>

2, 박층층 크로마토 그래피 < /p>

박층층 크로마토 그래피는 유리판이나 폴리에스테르 등 담체에 코팅 된 기질을 고정상으로, 액체를 유동상으로 사용하는 크로마토 그래피 방법입니다. 이 층 분석 방법은 흡착제 등의 물질을 운반체에 코팅하여 얇은 층을 형성한 다음 종이층 분석 조작에 따라 층을 펼치는 것이다. < /p>

3, 폴리아미드 박막층 크로마토 그래피 < /p>

폴리아미드의 극성 물질 흡착은 분리물과 수소 결합을 형성할 수 있기 때문이다. 이 수소 결합의 강약은 분리물과 폴리아미드 박막 사이의 흡착 능력의 크기를 결정한다. 층층을 분석할 때, 전층제와 분리물은 폴리아미드막 표면에서 경쟁하여 수소 결합을 형성한다. 따라서 적절한 전시제를 선택하여 폴리아미드막 표면에서 흡착, 흡착 해제, 재흡착, 재흡착 등의 연속 과정을 분리하면 분리 물질이 분리 목적을 달성할 수 있다. 친화층층의 원리는 잘 알려진 항원-항체, 호르몬-수용체, 효소-기질 등 특이성 반응의 메커니즘과 유사하며, 각 반응물 쌍 사이에는 어느 정도의 친화력이 있다. 효소와 기질의 반응에서 특수한 기질 (S) 이 특정 효소 (E) 와 결합되어 복합물 (E-S) 을 생산하는 것과 같다. 친화층 분석에서는 특이한 리간드 재능과 일정한 생명대분자 사이에 친화력이 있어 복합물을 생산한다. 친화층층은 효소-기질 반응과는 달리 전자가 반응할 때 리간드 (기질과 유사) 가 고체로 존재한다는 것이다. 후자가 반응할 때, 기질은 액상으로 존재한다. 본질적으로 친화층층은 인식력이 있는 리간드 L (효소에 대한 리간드는 기질, 억제제, 보조기 등이 될 수 있음) 을 활성기단이 들어 있는 매트릭스 M (예: 진지당 활성화 등) 에 경화시켜 친화흡착제 M-L 또는 고체상 전달체라고 한다. 고화 된 리간드는 여전히 특정 물질을 묶는 능력을 유지합니다. 따라서 고상 전달체를 작은 층층 기둥 (몇 밀리리터에서 수십 밀리리터의 침대 부피) 에 담은 후 분리할 샘플액을 그 기둥을 통과하게 한다. 이때 샘플에서 리간드에 친화력이 있는 물질 S 는 정전기 중력, 반드발력, 구조상보효과 등을 통해 고체상 전달체에 흡착될 수 있고, 친화력이 없거나 비특이적으로 흡착된 물질은 시작 완충액에 의해 세척되어 첫 번째 층층층분석봉을 형성한다. 그런 다음 시작 버퍼액의 pH 값을 적절히 변경하거나 이온 강도를 높이거나 억제제 등을 첨가하면 고체상 전달체에서 물질 S 를 떼어내고 M 번째 층층층산봉을 형성할 수 있다. 분명히 이 조작 절차를 통해 유효 성분과 불순물을 만족스럽게 분리할 수 있다.

샘플액에 두 개 이상의 물질이 고체상 전달체와 친화력 (크기 차이) 이 있을 경우 선택적 버퍼액을 사용하여 세탁하거나 분리할 수 있습니다. 사용한 고체상 전달체는 재생 처리 후 재사용할 수 있다. < /p>

위에서 설명한 친화층분석법은 이성 리간드 친화층분석이라고도 합니다. 이 밖에도 공통성 리간드 친화층분석법이라는 친화층분석법이 있다. 이 두 가지 친화층분석법에 비해 전자의 배합체는 일반적으로 복잡한 생명대분자 물질 (예: 항체, 수용체, 효소의 유사 기질 등) 으로 강한 흡착 선택성과 큰 결합력을 가지고 있다. 후자의 배합체는 일반적으로 간단한 소분자 물질 (예: 금속, 염료, 아미노산 등) 으로, 비용이 저렴하고 흡착 용량이 높으며 흡착 및 탈착 조건을 개선하여 크로마토 그래피의 해상도를 높일 수 있습니다. 초점층 분석도 일종의 기둥층 분석이다. 따라서, 다른 층층층분석과 마찬가지로, 전례대로 유동상이 있고, 그 유동상은 다완충제이고, 고정상은 다버퍼 교환제이다. < /p>

초점 층 분석 원리는 pH 그라데이션 용액의 형성, 단백질의 동작 및 초점 효과의 세 가지 측면에서 설명할 수 있습니다. < /p>

1, pH 그라데이션 용액의 형성 < /p>

이온 교환 크로마토 그래피에서 PH 그라데이션 용액의 형성은 그라데이션 혼합기에 의해 이루어진다. 예를 들어, 음이온 교환제를 사용하여 층을 분석할 때, pH 를 높음에서 낮음으로 선형적으로 변하는 그라데이션 용액을 준비하는 방법은 그라데이션기의 혼합실에 높은 pH 용액을 설치하고, 다른 실에는 낮은 pH 극한 용액을 설치한 다음 층층 기둥의 아래쪽 출구를 열어 세제액이 지속적으로 실린더를 통과하게 하는 것이다. 이때 기둥의 위쪽에서 아래쪽 용액까지의 pH 값은 높음에서 낮음으로 변경됩니다. 초점층 분석에서는 세제액이 멀티버퍼 교환제로 흐를 때 교환제 벨트에 완충력이 있는 전하기단이 있기 때문에 pH 그라데이션 용액이 자동으로 형성될 수 있다. 예를 들어, 기둥에 음이온교환제 PBE94 (고정상) 가 들어 있을 때, 먼저 시작 완충액으로 pH9 로 균형을 잡은 다음, pH6 이 들어 있는 멀티버퍼 물질 (유동상) 을 함유한 세제로 실린더를 통과하면, 멀티버퍼제 중 산성이 가장 강한 성분은 알칼리성 음이온 교환 쌍과 결합되어 중화작용이 발생한다. 로션이 계속 추가됨에 따라 기둥 내 각 점의 pH 값은 높음에서 낮음까지 점차 낮아진다. 이에 따라 J 세그먼트를 처리하면 층 분석 기둥의 맨 위에서 맨 아래까지 PH6 ~ 9 의 그라데이션이 형성됩니다. 초점 층 분석 기둥의 pH 그라데이션 용액은 침출 과정에서 자동으로 형성되지만, 침출이 진행됨에 따라 pH 그라데이션은 점차 아래로 이동하며, 바닥에서 흘러나오는 pH 는 9 에서 6 으로 점차 내려가 결국 이 값으로 일정하게 유지되면 층 분석 기둥의 pH 그라데이션도 사라집니다. < /p>

2, 단백질의 동작 < /p>

단백질의 전하가 등전점 (PI) 과 단층 기둥의 pH 값에 따라 달라집니다. 기둥의 pH 가 단백질의 PI 보다 낮을 때, 단백질은 양전하를 띠며, 음리교환제와 결합되지 않는다. 세제가 앞으로 이동함에 따라 고정상의 pH 값은 침출 시간이 길어짐에 따라 변한다. 단백질이 환경 pH 보다 높은 PI 로 이동하면 단백질은 양전행에서 음전하로 바뀌고 음이온 교환제와 결합됩니다. 세제의 통과로 단백질 주위의 환경 pH 가 다시 PI 보다 낮을 때 양전하를 띠고 교환제에서 탈착된다. 용리액이 기둥 바닥으로 이동함에 따라 이 과정이 반복되어 각종 단백질이 각자의 등전점에서 씻겨 분리 목적을 달성했다. < /p>

단백질마다 등전점이 다르다. 이들은 이온 교환제에 결합되기 전에 이동 거리가 다르다. 씻은 순서는 등전점에 따라 배열된다. < /p>

3, 초점 효과 < /p>

단백질이 등전점에 따라 pH 그라데이션 환경에 정렬되는 과정을 초점 효과라고 합니다. PH 기울기의 형성은 초점 효과의 전제 조건입니다. 단백질이 이미 pH 그라데이션을 형성한 층 분석 기둥에 추가되는 경우, 세제액의 연속 흐름으로 인해 등전점과 같은 pH 로 빠르게 이동합니다. 이 위치부터 단백질은 등전점 pH 가 나올 때까지 느린 속도로 흡착되고 흡착됩니다.

이 단백질 샘플을 씻기 전에 두 번째 동종 단백질 샘플을 추가하면, 후자는 세척액의 작용으로 같은 속도로 앞으로 이동하며 고정에 흡착되지 않고, 그 자체로 등전점에 가까운 환경 (즉, 첫 번째 작품의 느린 이동처) 으로 이동한다. 그런 다음 두 개의 샘플이 같은 속도로 이동하다가 결국 기둥 바닥에서 동시에 씻는다. 사실, 초점층 분석 과정에서 한 가지 샘플을 여러 번 첨가할 때, 먼저 가입자가 아직 씻지 않은 한, 그리고 어느 정도 초점이 맞춰질 시간이 있다면, 나머지 샘플은 다시 기둥에 추가될 수 있으며, 그 초점 과정은 모두 순조롭게 완성될 수 있고, 얻은 결과도 만족스럽다. 다양한 분조의 혼합 샘플이 색보계의 기화실에 들어가 기화를 한 후 기체를 띤다. 공기 흐름이 들어오면 기화된 물질이 인색보열에 들어가 고정상과 유동상에서 끊임없이 분배된다. 이상적인 상태에서는 기체-액체 사이에 용해되는 분배가 분배 계수 Kg 로 묘사될 수 있다. 분배 계수가 작을 때, 용질은 기둥에 머무는 시간이 짧아서 체류계수 (Rf) 가 크기 때문에 먼저 스펙트럼 기둥에서 흘러나와 감정기로 들어가고, 확대 시스템이 확대되면 출력 신호가 레코더에 자동으로 기록되며, 이때 나타나는 그래프는 스펙트럼, 즉 스펙트럼 피크라고도 합니다. 분배 계수가 크면 용질이 기둥에 머무는 시간이 길어지고 크로마토그래피가 레코더 뒤에 나타납니다. 물질마다 분배 계수가 다르기 때문에 혼합 샘플을 가스-액체 색상 스펙트럼 기둥을 통과할 때 포함된 그룹을 분리할 수 있습니다. < /p>

기색 스펙트럼 기둥이 효율적이고 해상도가 강한 중요한 이유는 이론탑 수 (N) 가 크기 때문이다. 모세관 가스 크로마토 그래피의 n 은 105~6 까지 도달 할 수 있습니다. 이론적 트레이 수를 늘리고 샘플 그룹을 낮추는 다른 분자가 전개층에서 확장되는 정도 (속도 이론) 를 높이면 기둥 효과를 크게 높일 수 있다. 다음은 트레이 이론과 속도 이론이 기둥 효과에 미치는 영향에 대해 논의한다. < /p>

1, 트레이 이론 < /p>

기둥이 일정 기간 길면 트레이 이론 높이 H 가 작을수록 샘플 각 구성 요소의 분배 횟수를 늘려 해상도를 높일 수 있습니다. 따라서 N=L/H 선형 할당과 트레이 간 세로 확산 무시 조건 하에서 샘플 그룹 보존 시간 tr, 피크 폭 W 또는 반봉 높이 폭 2ΔXi 에 따라 Martin 은 N 을 계산하는 공식을 내보냅니다. 샘플 그룹 피크 폭 값이 작을수록 이론적 트레이 수가 높아집니다. 실제로 색상 스펙트럼 분석을 수행할 때 최대 폭 값의 크기는 해상도의 높낮이를 측정하는 척도입니다. < /p>

2, 속도 이론 < /p>

트레이 이론에 따르면 h (트레이 이론 높이) 에서 일정 기간 동안 기둥 길이를 늘리면 기둥 효율성이 향상됩니다. 그러나 기둥이 너무 길면 분석 시간이 길어져 탐지의 민감도가 낮아진다. 따라서 실제로 h 를 줄이고 기둥 효과를 높이려고 노력해야합니다. < /p>

속도 이론은 주로 같은 샘플의 다른 분자를 분석하여 색상 스펙트럼 기둥에서 속도 차이로 인해 색상 스펙트럼 피크가 확장되는 정도를 분석하는 것이다. 와전류 확산, 세로 분자 확산 및 질량 전달 (유동 전승질 및 고정 전승질 포함) 과 속도 이론 (h) 의 밀접한 관계는 < /p>

H=A+B/U+C

세로 확산 (B/U) 은 분자 확산 항목이라고도 합니다. 세로 확산은 스펙트럼 기둥에서 샘플 분자의 유창도 (장애물이 있는지 여부), 흐름상 속도 (U) 등의 요인과 관련이 있다. 따라서 용질이 유동상에서의 확산 계수를 줄이고 용질이 유동상에서의 체류 시간을 줄이면 수직 확산을 줄일 수 있다. < /p>

전도저항 (C): 용질 분자가 기상과 기체-액체 인터페이스에서 교환되는 저항과 고정상 액막으로 들어가는 차이의 차이를 통칭하여 전도저항이라고 합니다.

전도저항은 각각 고정상 입자 지름의 제곱과 고정상 액막 두께에 비례한다. 고효율 액조스펙트럼은 고정상의 성질에 따라 고효율 젤색 스펙트럼, 소수성 고효율 액조색 스펙트럼, 역상 고효율 액조색 스펙트럼, 고효율 이온 교환 액조색 스펙트럼, 고효율 친화액조색 스펙트럼, 고효율 초점액조색 스펙트럼 등으로 나눌 수 있다. 서로 다른 유형의 고효율 액상색보로 각종 화합물을 분리하거나 분석하는 원리는 기본적으로 그에 상응하는 일반 액상층층의 원리와 비슷하다. 차이점은 고성능 액체 크로마토 그래피가 민감하고 빠르며 해상도가 높으며 반복성이 우수하며 크로마토 그래피에서 수행되어야한다는 것입니다. < /p>

고성능 액체 크로마토 그래피는 주로 주입 시스템, 주입 시스템, 분리 시스템, 검출 시스템 및 데이터 처리 시스템을 갖추고 있으며, 각 구성 요소 및 특성은 아래에 설명되어 있습니다. < /p>

1, 샘플 시스템 < /p>

는 일반적으로 다이어프램 사출 샘플러 또는 고압 샘플러를 사용하여 샘플 작업을 완료합니다. 샘플 양은 일정합니다. 이것은 분석 샘플의 반복성을 높이는 데 유익하다. < /p>

2, 주입 시스템 < /p>

이 시스템에는 고압 펌프, 이동상 메모리 및 그라데이션 세 부분이 포함되어 있습니다. 고압 펌프의 일반 압력은 l.47~4.4×107Pa 로 유속이 조절되고 안정적이며 고압 유동상이 층 기둥을 통과할 때 기둥에서 샘플의 확산 효과를 낮추고 기둥에서의 이동 속도를 높일 수 있어 해상도 향상, 샘플 재활용, 샘플의 생체 활성 유지 등에 유리하다. 흐름상 저장 및 그라데이션기는 용리액의 극성, 이온 강도, pH 값 변경, 경쟁 억제제 또는 트랜스젠더로 전환 등 고정상 및 샘플의 성질에 따라 흐름을 변경할 수 있습니다. 이렇게 하면 다양한 물질 (단 하나의 기단의 차이나 이종체만 있어도) 을 효과적으로 분리할 수 있다. < /p>

3, 분리 시스템 < /p>

이 시스템에는 스펙트럼 기둥, 연결관, 온도 조절기 등이 포함됩니다. 스펙트럼 기둥의 일반적인 길이는 10 ~ 50cm (두 개의 연결이 필요할 때 둘 사이에 연속 인계를 추가할 수 있음) 이며, 내경은 2 ~ 5mm 로, "양질의 스테인리스강이나 두꺼운 벽유리관 또는 티타늄 합금 등의 재료로 만들어졌으며, 내부에는 지름이 5 ~ 10μ m 입도가 있는 고정상 (기질과 고정액으로 구성됨) 이 들어 있다. 고정상의 기질은 기계적 강도가 높은 수지나 실리콘으로 이루어져 있는데, 모두 타성 (예: 실리콘 표면의 실리콘기단이 기본적으로 제거됨), 다공성 (구멍 지름이 1000 에 달할 수 있습니까? ) 및 표면적보다 큰 특징, 그리고 표면이 기계적 얼룩 (기색 스펙트럼의 고정상과 같은 준비) 을 거치거나 화학법으로 각종 기단 (예: 인산기, 계민기, 메틸기, 페닐, 아미노 또는 다양한 길이의 탄소사슬의 메탄기 등) 또는 리간드의 유기화합물을 결합한다. 따라서 이러한 고정은 상대적으로 구조가 다른 물질에 대해 좋은 선택성을 가지고 있다. 예를 들어, 다공성 실리콘 표면에 완두콩 렉틴 (PSA) 을 결합한 후에는 섬유세포 중 하나인 글리코겐을 분리할 수 있습니다. < /p>

또한 고정상 기질 입자가 작고 기둥 침대가 균일하고 촘촘한 상태에 이르기 때문에 소용돌이 확산 효과를 쉽게 낮출 수 있습니다. 기질의 입도는 작고, 미공은 얕으며, 샘플은 미공구 내에서 전도가 짧다. 이것들은 스펙트럼 폭을 줄이고 해상도를 높이는 데 유익하다. 기둥 효과 이론 분석에 따르면 기질의 세분성이 작을수록 탑판 이론의 수 N 이 커진다. 이것은 또한 기질의 세분성이 작아서 해상도를 높일 수 있다는 이치를 더욱 증명한다. < /p>

또한 고성능 액체 크로마토 그래피의 온도 조절기는 온도를 실온에서 60C 로 조절하여 물질 전달 속도를 향상시키고 분석 시간을 단축함으로써 크로마토 그래피 기둥의 효율성을 높일 수 있습니다. < /p>

4, 감지 시스템 < /p>

고성능 액체 크로마토 그래피에서 일반적으로 사용되는 검출기는 자외선 검출기, 차동 굴절 검출기 및 형광 검출기입니다. < /p>

(1) 자외선 검출기 < /p>

이 검출기는 자외선 (또는 가시광선) 에 흡수 성능 샘플이 있는 테스트에 적합합니다. 특징: 사용 범위가 넓다 (예: 단백질, 핵산, 아미노산, 뉴클레오티드, 폴리펩티드, 호르몬 등 모두 사용 가능). 감도가 높다 (검출 하한은 10-10? G/ml); 선형 범위 폭 온도와 유속의 변화에 민감하지 않습니다. 그라데이션 용액 세탁을 감지할 수 있는 샘플. < /p>

(2) 차동 굴절 검출기 < /p>

흐름과 굴절률이 다른 샘플 그룹은 차동 굴절 탐지기를 사용하여 감지할 수 있습니다. 현재 당류 화합물의 검사는 대부분 이 검사 시스템을 사용한다.

이 시스템은 다재다능하고 조작은 간단하지만 감도는 낮습니다 (검출 하한은 10-7? G/ml), 흐름상의 변화는 굴절률 변화를 일으킬 수 있으므로 추적 분석이나 그라데이션 용출 샘플 검사에는 적용되지 않습니다. < /p>

(3) 형광 감지기 < /p>

형광이 있는 모든 물질은 특정 조건 하에서 빛을 방출하는 형광 강도가 물질의 농도에 비례한다. 따라서 이 탐지기는 형광이 있는 유기화합물 (예: 다환 방향족, 아미노산, 아민, 비타민, 일부 단백질 등) 의 측정에만 적용되며 감도가 매우 높다 (검출 하한은 10-12 ~ 10-14? G/ml), 흔적 분석과 그라데이션 용출 작품의 검출을 모두 사용할 수 있습니다. < /p>

(5) 데이터 처리 시스템 < /p>

이 시스템은 테스트 데이터를 수집, 저장, 표시, 인쇄 및 처리하여 샘플 분리, 준비 또는 검증 작업을 올바르게 수행할 수 있도록 합니다. < /p >